Viber
Telegram
WhatsApp
Instagram
Лекарства от гепатита C
Комбинации препаратов в зависимости от генотипа вируса
Наименование Страна Производитель Цена за курс Заказать Для каких генотипов
Купить Софосбувир + Велпатасвир
Купить Velpanat ХИТ ПРОДАЖ! Индия Natco узнать цену Купить все
Купить Velasof ХИТ ПРОДАЖ! Индия Hetero узнать цену Купить все
Купить Lucisovel Шри-Ланка Lucius узнать цену Купить все
Купить SofoVel НОВИНКА! Пакистан AVA Pharmaceuticals (Pvt) Ltd узнать цену Купить все
Купить Софосбувир и Даклатасвир
Купить Hepcinat Plus ХИТ ПРОДАЖ! Индия Natco узнать цену Купить 1, 2, 3
Купить Sofovir и Daclahep Индия Hetero узнать цену Купить 1, 2, 3
Купить Sovihep и Dacihep Индия Zydus узнать цену Купить 1, 2, 3
Купить Lucisof и Lucidac Шри-Ланка Lucius узнать цену Купить 1, 2, 3
Купить SofoDac НОВИНКА! Пакистан AVA Pharmaceuticals (Pvt) Ltd узнать цену Купить 1, 2, 3
Купить Софосбувир + Ледипасвир
Купить Hepcinat LP Индия Natco узнать цену Купить 1, 4
Купить Ledifos Индия Hetero узнать цену Купить 1, 4
Купить Ledihep Индия Zydus узнать цену Купить 1, 4
Купить Lucisole Шри-Ланка Lucius узнать цену Купить 1, 4
Купить Vihep SL ХИТ ПРОДАЖ! Венесуэла Vargas узнать цену Купить 1, 4

Полиплоидные клетки гепатоциты

A Role for Polyploidy in the Tumorigenicity of Pim-1-Expressing Human Prostate and Mammary Epithelial Cells
Источник: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2440349/

Задуманные и разработанные эксперименты: SA MR. Выполнял эксперименты: MR OF Rv. Проанализированы данные: SA MR Rv. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: SH SA. Написал газету: SA MR.

Полиплоидия является заметной особенностью многих раковых заболеваний человека, и уже давно выдвигается гипотеза о том, что полиплоидия может способствовать развитию опухоли, способствуя геномной нестабильности. В этом исследовании мы исследовали, может ли полиплоидия, индуцированная соответствующим онкогеном, способствовать геномной нестабильности и туморогенности в эпителиальных клетках человека.

Когда онкогенный серин-треонин-киназа Pim-1 сверхэкспрессируется в иммортализованных, не опухолевых клетках предстательной железы человека и эпителиальных клеток молочной железы, эти клетки постепенно превращаются в полиплоидии и становятся опухолегенными. Чтобы оценить вклад полиплоидии в туморогенность, мы получили отсортированные сопоставленные популяции диплоидных и полиплоидных клеток, экспрессирующих эквивалентные уровни белка Pim-1. Спектральный кариотипирование выявил признаки появления числовых и структурных хромосомных аномалий в полиплоидных клетках, подтверждая предположение, что полиплоидия способствует хромосомной нестабильности. Полиплоидные клетки отображали интактный путь p53 / p21, указывая на то, что жизнеспособность полиплоидных клеток в этой системе не зависит от инактивации сигнального пути p53. Примечательно, что только отсортированные полиплоидные клетки были опухолегенными in vitro и in vivo.

Наши результаты подтверждают, что полиплоидия может способствовать хромосомной нестабильности и инициированию опухолевого генеза в эпителиальных клетках человека.

Aneuploidy является общей характеристикой рака человека и был предложен в качестве драйвера опухолевого генеза [1], [2]. Во время инициирования опухоли анеуплоидия может возникать при полиплоидизации, где нестабильные тетраплоидные интермедиаты вызывают дальнейшие хромосомные аномалии, включая хромосомные приросты, потери и транслокации [3], [4]. В опухолях человека анеуплоидия встречается при предраковых поражениях шейки матки [5] — [7], головы и шеи [8], толстой кишки [5], [9], пищевода [10] и простаты [11]. Тем не менее, вопрос о том, является ли геномная нестабильность движущей силой развития рака, или последствием опухолегенеза, остается предметом дискуссий [12]. Недавнее исследование Фудзивара и др. Предоставило экспериментальную поддержку роли полиплоидии в опухолегенезе с использованием p53-нулевых тетраплоидных мышечных эпителиальных клеток молочной железы [13]. Эти авторы показали, что тетраплоидные клетки, полученные при временном лечении ингибитором цитокинеза, дигидроцитоталазином В, были опухолегенными in vivo. Однако влияние анеуплоидии на туморогенность может быть зависимым от контекста. У мышей с уменьшенными уровнями специфичного для митоза центромерсодержащего моторного белка CENP-E полученная анеуплоидия способствует опухолегенности в некоторых тканях при подавлении развития опухоли у других [14]. Эти данные подчеркивают важность оценки роли хромосомной неустойчивости в опухолегенезе у конкретных типов клеток и видов животных.

В настоящем исследовании мы рассмотрели вопрос о том, может ли полиплоидия способствовать опухолегенезу в эпителиальных клетках человека с использованием модели спонтанной полиплоидии, индуцированной онкогеном Pim-1. Онкоген Pim-1 представляет собой серин-треониновую киназу, участвующую в развитии различных опухолей, включая лимфомы и карциномы предстательной железы [15] — [17]. Ранее мы продемонстрировали, что избыточная экспрессия Pim-1 в клетках предстательной железы и груди человека приводит к постепенному появлению полиплоидии [18], [19]. Примечательно, что Pim-1 изобильно экспрессируется в линии мегакариоцитов, где он участвует в регуляции полиплоидии [20], предполагая, что полиплоидия, индуцированная Pim-1, в опухолегенезе может быть патологическим проявлением того же процесса. Поскольку эволюция полиплоидии в экспрессирующих клетках Pim-1 является стохастической [19], это позволило нам получить отсортированные экспрессирующие Pim-1 клетки того же прохода, которые являются диплоидными или полиплоидными на основе их содержания ДНК. Наши исследования с использованием этих клеток показывают, что полиплоидия, индуцированная Pim-1, может способствовать развитию хромосомных аномалий и опухолегенности в клетках предстательной железы человека и эпителиальных клеток молочной железы.

Чтобы исследовать онкогенные функции Pim-1 в эпителиальных клетках предстательной железы, мы стабильно избыточно экспрессировали Pim-1 в иммортализованных, не опухолевых эпителиальных клетках RWPE1 простаты (рис. 1A). Как сообщалось ранее [18], [19], поздний проток RWPE1-Pim-1 клетки являются полиплоидными (тетраплоидными), как показано FACS для содержания ДНК и FISH, тогда как клетки раннего прохода являются диплоидами (фиг. 1B, C). Мы инъецировали эти клетки матригелем в боковые стороны голых мышей подкожно для образования ксенотрансплантатов. Анализ ткани ксенотрансплантата указывает на то, что только поздние проходы клетки RWPE1-Pim-1 образовывали небольшие опухоли (40% случаев, n = 10, средний объем опухоли = 44,02 ± 12,03 мм3 во время жертвоприношения), а как ранний, так и поздний контроль прохода RWPE1- Neo-клетки (n = 10 каждый), а также ранние проходы RWPE1-Pim-1 клетки (n = 10) образовывали только небольшие доброкачественные железы (рис. 1D). Таким образом, в этом анализе опухолегенность, по-видимому, зависит как от экспрессии Pim-1, так и от длительного прохождения и / или полиплоидии.

(A) Вестерн-блоттинг для Pim-1 и актина в клетках RWPE1, сверхэкспрессирующих Pim-1 или векторное управление (Neo). Показаны клетки раннего и позднего прохода. (B) Профили клеточного цикла сверхэкспрессирующих клеток RWPE1 Pim-1 показывают полиплоидии в клетках позднего прохода. (C) Анализ FISH позднего прохода Pim-1, сверхэкспрессирующий клетки RWPE1 с использованием зондов для хромосом 13 и 21, показывает удвоение хромосом. (D) Образцы изображений, окрашенных H & E, из ксенотрансплантатов RWPE1. Только поздний проток экспрессирующие клетки Pim-1 были опухолегенными.

Результаты наших экспериментов с ксенотрансплантатом показали, что полиплоидия может быть фактором, способствующим опухолегенности поздних проходов клеток RWPE1-Pim-1, поскольку контрольные неполиплоидные клетки RWPE1-Neo того же позднего прохода, а также ранний проток Pim-1 экспрессирующие клетки не были опухолегенными. Чтобы непосредственно исследовать это, мы воспользовались постепенным характером, с помощью которого полиплоидия возникает в культурах клеток, экспрессирующих Pim-1. Ранее мы показали, используя три разных экспериментальных подхода, которые все Pim-1-экспрессирующие клетки могут стать полиплоидными и делать это стохастическим способом [19]. Мы отсортировали клетки промежуточного прохода на основе содержания ДНК с помощью FACS для получения сопоставимых диплоидных (2N) и полиплоидных (≥4N) клеточных популяций одного и того же прохода (рисунок 2A). После сортировки клетки стабильно поддерживали диплоидный или тетраплоидный профиль FACS. Важно отметить, что уровни экспрессии Pim-1, а также ряда клеточных циклов и антиапоптотических молекул (включая Myc, Cyclin E, Cyclin D2, Bcl-2 и Bcl-XL) были одинаковыми как в диплоидных, так и в полиплоидных клетках (рис. 2B). Примечательно, что Bcl-2, который является известной мишенью Pim-1 [21], активируется в клетках RWPE1-Pim-1 относительно контрольных клеток RWPE1-Neo; однако отсортированные диплоидные и полиплоидные клетки RWPE1-Pim-1 экспрессировали эквивалентные уровни Bcl-2 (рисунок 2B). Мы не обнаружили существенных различий в скоростях пролиферации диплоидных и полиплоидных клеток RWPE1-Pim-1 in vitro (рисунок 2C).

(A) Схема, показывающая схему выделения диплоидных (2N) и полиплоидных (> 4N) клеток Pim-1 с помощью сортировки FACS на основе содержания ДНК. Нижняя панель представляет собой профиль FACS отсортированных ячеек после нескольких проходов, чтобы получить достаточное количество клеток для анализа FACS. (B) Вестерн-блоттинг Pim-1 и других маркеров в сортированных клетках FACS показывает сходные уровни экспрессии в сортированных диплоидных и полиплоидных клетках. (C) подсчет клеток диплоидных и полиплоидных сверхэкспрессирующих клеток Pim-1. (D) Вестерн-блоттинг показывает, что путь р53 не поврежден во всех клетках RWPE1, отсортированных по FACS, как показано индукцией р53 и р21 после лечения даунорубицином.

В предыдущих исследованиях было высказано предположение о существовании p53-зависимой контрольной точки — «контрольной точки тетраплоидия», которая ограничивает пролиферацию полиплоидных клеток, хотя существование такой «тетраплоидной контрольной точки» оспаривается [4], [22]. Чтобы определить, инактивирован ли сигнальный путь p53 в отсортированных полиплоидных клетках, мы обработали клетки химиотерапевтическим агентом даунорубицином. Мы наблюдали стабилизацию р53, а также индукцию его молекулы-мишени р21 после лечения даунорубицином, что указывает на то, что путь р53 не поврежден в этих клетках (рис. 2D). Это может показаться неожиданным, поскольку клетки RWPE1 были увековечены вирусом папилломы человека типа 18 (HPV-18), и белок E6 HPV-18, как известно, мешает функции р53 [23]. Тем не менее, сообщалось, что путь р53 функционирует в некоторых клетках, иммортализованных ВПЧ [24], что согласуется с нашими результатами.

Чтобы получить более полное представление о геномных изменениях в полиплоидных клетках, мы провели анализ кариотипа. Спектральный кариотипинг (SKY) показал, что 100% контрольных клеток RWPE1-Neo (n = 40) и диплоидных клеток RWPE1-Pim-1 (n = 31) были близки к диплоидным, содержащим от 45 до 50 хромосом на клетку (рис. 3А, В). Напротив, большинство полиплоидных клеток RWPE1-Pim-1 (81%, n = 31) были почти тетраплоидными, содержащими 91-100 хромосом. Помимо цельнохромосомных выигрышей полиплоидные клетки Pim-1 проявляли широкий спектр как численных, так и структурных аберраций, включая хромосомные транслокации и делеции (рис. 3B, C), тогда как контрольные неоплододейные клетки Neo и Pim-1 имели меньше структурных нарушений и числовых вариаций , Хотя число структурных хромосомных аберраций на клетку в полиплоидных клетках было примерно в два раза выше, чем в контрольных Neo или диплоидных клетках, количество структурных хромосомных аберраций на хромосому было почти одинаковым во всех группах (рис. S1), что указывает на то, что более высокое число хромосом в полиплоидные клетки являются основным фактором роста наблюдаемых хромосомных аномалий. Тем не менее, хотя большинство полиплоидных клеток поделились одной и той же хромосомной транслокацией и делецией с контрольными нео и диплоидными клетками, что свидетельствует об их общем происхождении, было также несколько полиплоидных клеточно-специфических хромосомных транслокаций и делеций, присутствующих в различных фракциях полиплоидных клеток (рис. 3C). Эти результаты указывают на наличие хромосомной неустойчивости и появление анеуплоидии в отсортированных полиплоидных клетках.

(A) Процент клеток, показывающих общее количество хромосом, числовые и структурные аберрации из FACS-отсортированных клеток RWPE1. Всего от 31 до 40 метафазных спредов анализировали на образец и оценивали на количество хромосом, численные аберрации и структурные аберрации. (B) Репрезентативные изображения SKY сортированных неопластических, диплоидных и полиплоидных клеток RWPE1-Pim-1. Neo: 49, X, del (Y), + 5, t (9; 20; X), t (11; 18), + 12, del (12), t (12; 21), t (14; 18 ), + 15, т (14; 18) + 20, т (18; 20). Diploid: 49, X, del (Y), t (3; 4), + 5, + 5, t (9; 20; 9), + 12, t (5; 12) (12; 21) 14; 18), т (7; 18) + 20, т (17; 18; 20). Полиплоид: 97, XX, del (Y), + 1, + 1, + 1, t (1; 5), + 2, + 2, + 3, + 3, + 3, t (3; 7), + 4 + 4 + 5 + 5 + 5 + 5 + 5 + 5, т (5; 21) + 6 + 6 + 7 + 8 + 8 + 9 + 9 , т (9; 20; 9) × 2 + 10 + 10 + 11 + 11 + 12 + 12 + 12 + 12, т (5; 12) × 2 (12; 21) & times; 2 + 13 + 13 + 14 + 14, т (14; 18) & times; 2 + 15 + 15 + 16 + 16 + 17 + 17 + 18 + 18, т (7 ; 18) & times; 2 + 19 + 19 + 20 + 20 + 20 + 20, т (17; 18; 20) & times; 2 + 21 + 22. (C) Таблица, показывающая структурные хромосомные аберрации. Показаны числа наблюдаемых производных хромосом. Полиплоид-специфические аномалии выделены жирным шрифтом.

Далее мы рассмотрели роль полиплоидии и последующей хромосомной неустойчивости в туморогенности in vitro клеток RWPE1-Pim-1, оценив способность сортированных клеток расти в анкерном режиме в мягком агаре. Как показано на фиг.4А, только полиплоидные клетки RWPE1-Pim-1 образовывали колонии в мягком агаре, несмотря на то, что уровни экспрессии Pim-1 были одинаковыми как в диплоидных, так и в полиплоидных клетках, как отмечено ранее на фиг. 2B, и эти клетки были перенесены за тот же проход. Эти данные показывают, что экспрессия Pim-1 сама по себе недостаточна для стимулирования роста в мягком агаре и что полиплоидия (и результирующая геномная нестабильность) может взаимодействовать с Pim-1 для содействия опухолегенности эпителиальных клеток предстательной железы. Чтобы определить, может ли геномная неустойчивость из-за полиплоидии способствовать опухолеобразованию in vivo, мы провели эксперименты по рекомбинации тканей. Известно, что эпителий предстательной железы человека обладает способностью генерировать структуры предстательной железы в сочетании с мочеполовой мезенхимой крысы (UGM) и имплантируется под почечную капсулу иммунодефицитных мышей [25]. Мы объединили сортированный диплоидный и полиплоидный RWPE1-Pim-1, а также контролировали клетки RWPE1-Neo с UGM и прививали их под почечную капсулу иммунодефицитных мышей.

(A) Анализ мягкого агара с подсчетом колоний в клетках RWPE1, отсортированных по FACS. Были подсчитаны колонии диаметром более 0,5 мм. Результаты представляют собой средние трехкратные эксперименты. * Р

Через двенадцать недель после прививки все трансплантаты от контроля Neo (n = 4) и диплоидные клетки (n = 8) образовали в основном нормальные, доброкачественные структуры железы. Однако 3 из 8 трансплантатов из полиплоидных клеток содержали очаги карциномы in situ (рис. 4B), свидетельствующие о потере базального клеточного маркера p63 и повышенном уровне митоза, как показано окрашиванием фосфогистона H3 (рисунок 4B). Для подтверждения происхождения RWPE1 желез использовали человеческое специфическое окрашивание Ku70. В совокупности эти результаты показывают, что полиплоидия, индуцированная Pim-1, способствует геномной нестабильности, которая способствует опухолегенности.

В дальнейшем мы попытались определить, распространяется ли роль Pim-1-индуцированной полиплоидии в развитии геномной неустойчивости и туморогенности на другие типы клеток человека. Кроме того, мы хотели рассмотреть это явление в клетках, иммортализованных с помощью иных средств, чем онкогенный вирус (то есть ВПЧ). Мы использовали клетки hTERT-HME1, которые являются не опухолегенными эпителиальными клетками молочной железы человека, иммортализованными экспрессией каталатической субъединицы теломеразы человека, hTERT. Как и наши данные с клетками простаты RWPE1, мы обнаружили, что только полиплоидный поздний проход Pim-1, экспрессирующий клетки hTERT-HME1, образовывал колонии в мягком агаре (рис. S2). Затем мы выделили согласованные диплоидные / полиплоидные PIM-1-экспрессирующие клетки hTERT-HME1 того же прохода путем сортировки клеток. Профиль FACS сортированных клеток показал, что диплоидные и контрольные клетки Neo, полученные из Pom-1, поддерживают содержание диплоидной ДНК, тогда как полиплоидные клетки Pim-1 являются почти исключительно тетраплоидными (рисунок 5A). Уровни экспрессии Pim-1, как и Myc, были сопоставимы как в диплоидных, так и в полиплоидных клетках hTERT-HME1 (рис. 5B). Мы наблюдали умеренное увеличение Cyclin E в полиплоидных клетках, что может быть связано с повышенной скоростью пролиферации полиплоидных клеток, полученных из hTERT-HME1 in vitro (рис. 5C). Это контрастирует с случаем полиплоидных клеток, полученных из RWPE1, которые показывают сравнимую скорость распространения по сравнению с их диплоидными аналогами. Кроме того, мы исследовали экспрессию различных клеточных маркеров в полиплоидных клетках, включая ранние клетки-предшественники CD44, нестин и цитокератин 5 с помощью иммунофлуоресценции. Мы не обнаружили существенных различий между диплоидными и полиплоидными клетками (рис. S3). Мы также исследовали путь p53 в полиплоидных клетках, полученных из hTERT-HME1, обработкой клеток даунорубицином с последующим вестерн-блоттингом для p53 и p21. Результаты показывают, что, как и в полиплоидных клетках RWPE1, этот путь не поврежден в клетках hTERT-HME1 (рис. 5D). Таким образом, жизнеспособность рассматриваемых здесь полиплоидных клеток не зависит от инактивации р53. Поскольку Pim-1 имеет функции выживания, он может заменить потерю р53 в повышении жизнеспособности появляющихся полиплоидных клеток.

(A) FACS после сортировки ячейки. Ячейки hTERT-HME1 были отсортированы на основе содержания ДНК. (B) Вестерн-блоттинг Pim-1 и других маркеров в сортированных клетках. Уровни экспрессии Pim-1 сходны в диплоидных и полиплоидных клетках. (C) подсчет клеток Neo, диплоидных и полиплоидных сверхэкспрессирующих клеток Pim-1. (D) Вестерн-блоттинг для p21 и p53 после лечения даунорубицином показывает, что функция p53 не повреждена во всех FACT-клетках hTERT-HME1.

Кариотипы контрольных Neo и диплоидных клеток Pim-1-hTERT-HME1 были стабильными и однородными с небольшими численными и структурными отклонениями (рис. 6). Все контрольные клетки Neo (n = 40) и почти все диплоидные клетки Pim-1 (39 из 40) были диплоидными или почти диплоидными, содержащими от 45 до 48 хромосом. Напротив, все полиплоидные клетки (n = 13) содержали от 79 до 89 хромосомных чисел, что свидетельствует о почти тетраплоидии (рис. 6A). Наблюдаемые числа хромосом в полиплоидных клетках (79-89 хромосом) ниже предсказанного удвоения количества хромосом в клетках Neo / Diploid (90-98 хромосом). Это говорит о том, что субтетраплоидную клеточную популяцию можно получить либо из тетраплоидных клеток, либо за счет хромосомной потери, либо из диплоидной популяции неизвестными механизмами. Кроме того, полиплоидные клетки отображали значительно больше структурных хромосомных аномалий, чем контрольные клетки (фиг. 6A-C). Чтобы получить дополнительную информацию об эволюции опухолевых субпопуляций среди полиплоидных клеток, мы выделили и культивировали клетки из колоний мягких агаров, полученных из полиплоидных клеток (см. Рисунок 7А ниже). По анализу SKY клетки, полученные из мягкого агара, отображали увеличенные числовые и структурные аберрации, похожие на полиплоидные клетки (фиг. 6A-C). Кроме того, число структурных хромосомных аберраций на хромосому было выше в полиплоидных клетках и клетках, полученных из мягкого агара, по сравнению с контрольными Neo или диплоидными клетками (рис. S1). Эти результаты свидетельствуют о том, что хромосомные аномалии, наблюдаемые в этих клетках, обусловлены не только увеличением хромосомных чисел, но и следствием активной хромосомной нестабильности. Примечательно, что 7 из 25 из исследованных клеток, полученных из мягкого агара, содержали уникальную хромосомную транслокацию t (8; 20), что еще больше свидетельствовало о хромосомной нестабильности в эволюции опухолевых популяций (рис. 6C).

(A) Процент клеток, показывающих общее количество хромосом, числовые и структурные аберрации из FACS-отсортированных клеток hTERT-HME1. Обратите внимание, что кариотипы полиплоидных и мягких агаровых клеток очень гетерогенны, тогда как кариотипы контрольных нео и диплоидных клеток более однородны. Всего от 13 до 40 метафазных спредов анализировали на образец и оценивали на количество хромосом, численные аберрации и структурные аберрации. (B) Репрезентативные изображения SKY из каждой ячейки, отобранной FACS hTERT-HME1. Нео: 45, XX, т (6; 17), — 17. Диплоид: 46, XX, del (5), t (5; 8). Полиплоид: 89, XXXX, + 1, + 1, t (1; 2), + 2, + 3, + 3, + 4, + 5, + 5, + 5, del (5), + 6, + 6 + 7 + 7 + 8 + 8 + 9 + 9 + 10 + 10 + 11 + 11, дель (11) + 12 + 12 + 13 + 13 + 14 + 15 + 15 + 16 + 16 + 17 + 17, т (15; 17), + 18, + 18, + 19 + 19 + 20 + 20 + 21, + 21, +22. Мягкий агар: 89, XXX, + 1, + 1, t (1; 2), + 2, + 3, + 3, + 4, + 5, + 5, + 5, del (5), + 6, + 6 + 7 + 7 + 8 + 8 + 8, т (8; 20), + 9 + 9 + 10 + 10 + 11 + 11, дель (11) + 12, + 12 + 13 + 13 + 14 + 14 + 15 + 16 + 16 + 17 + 17 + 18 + 18 + 19 + 19 + 20 + 21 + 21 + 22 + 22. (C) Таблицы, показывающие производные хромосомы в разных отсортированных типах клеток. Показаны числа наблюдаемых производных хромосом. Выведенные жирным шрифтом полиплоидные и мягкие агары выделены жирным шрифтом.

Анализ мягкого агара FACS-сортированных диплоидных и полиплоидных hTERT-HME1 PIM-1 сверхэкспрессирующих клеток и контрольных Neo-клеток. Обратите внимание на более крупные колонии в полиплоидных клетках. Колонии диаметром более 1 мм подсчитывали из трех частей 60-миллиметровой посуды. Оригинальное увеличение: 10 ×. (B) Мы изолировали клетки из колоний мягких агаров, образованных полиплоидными клетками, показанными на фиг.7А. Опухольгический потенциал этих полиплоидных клеток, полученных из мягкого агара, сравнивали бок о бок с генотипом родительских полиплоидных клеток методом мягкого агара. Клетки с мягким агаром образовывали колонии большего размера с более высокой частотой, чем родительская полиплоидная клеточная популяция. Оригинальное увеличение; 4 ×.

Турогенность сортированных клеток hTERT-HME1 тестировали путем независимого от фиксации роста в мягком агаре. Полиплоидные клетки образовывали устойчивые колонии в мягком агаре (рис. 7А), в отличие от диплоидных или нео-контрольных клеток, что указывает на то, что про-туморигенный эффект полиплоидии, индуцированной Pim-1, распространяется на разные типы клеток. Кроме того, клетки, полученные из мягкого агара, образовывали колонии большего размера с более высокой частотой, чем полиплоидные клетки, что указывает на больший объем опухолевых потенциалов этих клеток (рис. 7B).

В этом исследовании мы продемонстрировали, что полиплоидия, индуцированная онкогенной киназой Pim-1, может способствовать развитию анеуплоидии и туморогенности в эпителиальных клетках человека. Используя генетически подобранные диплоидные и полиплоидные клетки предстательной железы и молочных эпителиальных клеток FACS, мы продемонстрировали, что только полиплоидные клетки были опухолегенными, несмотря на то, что они выражали эквивалентные уровни онкогена Pim-1. Таким образом, сверхэкспрессия Pim-1 сама по себе в отсутствие полиплоидии недостаточна для туморогенности в нашей экспериментальной системе. Мы также подтверждаем, что опухолегенность полиплоидных клеток, скорее всего, обусловлена ​​внутренней хромосомной неустойчивостью, присутствующей в этих клетках, в том числе цельной хромосомной природой / потерями, а также структурными аномалиями, включая делеции и транслокацию. Более того, наши данные показали, что выживаемость полиплоидных клеток не зависит от инактивации пути р53, предполагая, что Pim-1 может заменить потерю р53.

Геномическая нестабильность является отличительной чертой рака человека, и большинство карцином проявляют грубые хромосомные аномалии. Считается, что полиплоидизация (в частности, тетраплоидия) может представлять собой важную промежуточную стадию инициирования опухоли посредством ее способности катализировать развитие дополнительных хромосомных аномалий из-за ошибок сегрегации, возникающих в результате множественных центросом и дополнительных хромосом [3], [26]. Разнообразный хромосомный ландшафт результирующих клеток может затем обеспечить разрешающий субстрат, на котором селективные силы могут воздействовать на развитие опухоли. При раке предстательной железы аномальные диплоидные раковые опухоли могут представлять собой раннюю стадию прогрессирования плоидности, а аномалии плоидности ДНК возникают в доброкачественной ткани предстательной железы, прилегающей к многим ракам предстательной железы [27], [28]. При раке молочной железы существует также корреляция между анеуплоидией и прогрессированием опухоли [29] — [31]. Однако, несмотря на корреляцию между анеуплоидией и туморогенностью, прямые тесты на роль анеуплоидии в развитии опухолей были отчасти затруднены из-за отсутствия подходящих экспериментальных систем, особенно из клеток человека. Одно из более прямых испытаний на роль тетраплоидии в развитии опухолегенности основано на химической обработке ингибитором цитокинеза, дигидроцитоталазином B (DCB), чтобы индуцировать тетраплоидию в p53-нулевых эпителиальных клетках мышиной мыши (MMECs) [13]. В этом исследовании авторы продемонстрировали, что тетраплоиды могут способствовать хромосомной нестабильности и опухолегенезу. Наши данные согласуются с этим выводом. Однако наша система в нескольких отношениях отличается от модели MMEC: (i) Мы использовали человеческие эпителиальные клетки, которые трудно трансформировать [32], [33]. (ii) Развитие полиплоидии в нашей системе происходит спонтанно, следуя выражению онкогена Pim-1. Поскольку многие гены, связанные с раком, были связаны с развитием полиплоидии, например, MYC [34], APC [35], [36], Pim-1 [18], [19], BRCA2 [37] и Aurora- A [38], наша модель может отражать фактический путь инициирования опухоли. (iii) В нашей системе полиплоидные клетки возникают в результате интактного пути p53, тогда как p53 + / + тетраплоидные MMEC не выживают [13]. Сообщалось, что потеря р53 способствует образованию тетраплоидии и выживанию клеток с геномной нестабильностью [39], [40].

Некоторые исследования указывают на существование p53-зависимой контрольной точки, которая предотвращает распространение тетраплоидных клеток [41], в то время как другие исследования ставят под сомнение существование такой «тетраплоидной контрольной точки» [4], [22]. Тем не менее, тетраплоидные клетки, как представляется, в целом менее подходят, чем диплоидные клетки. Например, как сообщается, тетраплоидные клетки имеют повышенную скорость спонтанного апоптоза, которая зависит от экспрессии р53 [42]. Важно отметить, что сообщалось, что Pim-1 повышает выживаемость клеток путем повышения активности Bcl-2 [21], а также инактивации проапоптотического белкового белка путем фосфорилирования [43]. Таким образом, возможно, что Pim-1, с его функциями выживания, заменяет потерю р53, чтобы обеспечить выживание полиплоидных клеток в нашей системе.

Дальнейший анализ полиплоидных клеток до и после образования опухоли необходим для получения дополнительной информации о продвижении опухолевого генеза полиплоидией. Тем не менее, интересно отметить, что гипотеза анеуплоидии предсказывает длительную латентность для опухолевого генеза, а также клональность. Если движущей силой для опухолегенеза является присущий анеуплоидный кариотип, инициированный канцерогеном или возникающий спонтанно, результирующая хромосомная нестабильность будет способствовать появлению предростопластических и в конечном итоге неопластических кариотипов. Ожидается, что генерация неопластических клеточных видов будет медленной и, следовательно, клональной [26], [44]. Туморигенность, индуцированная полиплоидией, может также следовать расходящимся маршрутам в зависимости от конкретного генерируемого кариотипа. В соответствии с этим понятием, полиплоидные простатит и клетки эпителия молочной железы, которые мы создали, отображали очень отличительные кариотипы, хотя обе клетки были опухолегенными. Они также продемонстрировали некоторые фенотипические различия. Полиплоидные клетки RWPE-Pim-1 имели сходную скорость пролиферации in vitro по сравнению с их диплоидными аналогами, тогда как полиплоидные клетки hTERT-HME1-Pim-1 размножались гораздо быстрее, чем диплоидные клетки.

Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что полиплоидия, способствуя развитию анеуплоидии, является промотором опухолевого генеза в клетках человека. Этот факт в сочетании с наблюдением, что многие опухоли человека проявляют полиплоидию, делают полиплоидные клетки привлекательными мишенями для новых терапевтических средств.

Профили предстательной железы RWPE1 и hTERT-HME1, стабильно экспрессирующие Pim-1, были получены, как описано [18], [19]. Ранние, средние и поздние проходы определяют, основываясь на появлении полиплоидии на культуре in vitro, как описано ранее [19]; ранний проход 1-20; средний проход 25-40; поздний проход> 40. От 6 до 8 недель старых голых голых мышей, мужских тяжелых комбинированных иммунодефицитных (SCID) мышей [C.B.17 / IcrHsd-scid] и беременных крыс Sprague-Dawley получали из NCI-Fredrick, Лаборатории Джексона или лаборатории Harlan, соответственно. Антитела, используемые для вестерн-блоттинга, включают анти-Pim-1 (12H8), Myc (9E10), Cyclin E (M-20), Cyclin D2 (C-17), Bcl-2 (100), Bcl-XL (H-5 ), p53 (DO-1), p21 (F-5) и актин (C-11) (все из биотехнологии Санта-Крус). Для иммуноокрашивания использовали антитела против р63 (PPM 201 AA, H, Biocare Medical), фосфогистон H3 S10 (06-570, Upstate) и Ku 70 (as10878, abcam).

Клетки фиксировали 70-100% холодным этанолом и ДНК окрашивали иодидом пропидия для анализа, как описано [18], [19]. Сортировка клеток на основе содержания ДНК выполнялась, как описано [19]. Вкратце, клетки промежуточного прохода (прохода 25) окрашивали 5 мкг / мл Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich) в течение 90 минут при 37 ° C и сортировали в соответствии с содержанием ДНК (2N, 4N и> 4N) с использованием сортировщика клеток , Для наших экспериментов использовались диплоидные (2N ДНК) и полиплоидные (> 4N ДНК) клетки. 4N ДНК-клетки не использовались, так как это смешанная популяция фазы G2 / M 2N-ДНК-клеток и фаза G1 из 4N-ДНК-клеток.

Для анализа вестерн-блоттинга были получены и обработаны полные клеточные лизаты и образцы, как описано [18], [19] с указанными антителами. Для лечения даунорубицином клетки RWPE-1 или hTERT-HME1 обрабатывали 0,5 мкмону даунорубицином (Sigma-Aldrich, D8809) в течение 6 и 24 ч, а для клеточного лизата были получены целые клеточные лизаты. Иммуногистохимия была проведена, как описано ранее [45].

Они были выполнены, как описано [46]. Вкратце, 104 клетки смешивали с 0,3% мягким агаром и помещали сверху 0,6% донного агара, засеянного на каждой из 60 мм пластин. Для каждого образца проводили трехслойное покрытие. Клетки инкубировали при 37 ° С в течение 2 недель для образования колоний и окрашивали 0,05% кристаллическим фиолетовым цветом для подсчета колоний. Изображения были захвачены инвертированным широкопольным микроскопом Leica DM IRB с камерой Nikon DXM1200C.

Для ксенотрансплантатов 3 × 106 клеток RWPE1 смешивали с 400 мкл матригеля и вводили подкожно безводным мышам 6-8 недель. Мышей умерщвляли через 8 месяцев для гистологического анализа. Размер опухоли измеряли с помощью суппорта, и гистология всех образцов была исследована после жертвоприношения. Для рекомбинации ткани 105 отсортированных RWPE1-Pim-1, а также контрольных клеток RWPE1-Neo рекомбинировали с 2,5 × 105 крыс-урогенитальной мезенхимой (UGM) и суспендировали в хвостовом коллагене крысы (50 мкл / трансплантат). Коллаген крысы готовили, как описано ранее [25]. Вкратце, хвосты от зрелых крыс были взяты и пропитаны в 70% этаноле, а затем кожа была разделена на хвостовой корень и очищена. Хвосты были отрезаны, и каждое сухожилие дразнили, чтобы отделить волокно. Затем сухожилия переносили в уксусную кислоту, центрифугировали и хранили при 4 ° С до использования. Крыса UGM была приготовлена ​​из 18-дневных эмбриональных плодов. Урогенитальные пазухи были вскрыты от плодов и разделены на эпителиальные и мезенхимальные компоненты триптическим расщеплением, как описано ранее [25]. Отдельные клетки UGM затем получали путем 90-минутного переваривания при 37 ° С с 187 единиц / мл коллагеназы (Gibco-BRL). Рекомбинанты инкубировали в течение ночи в инкубаторе с увлажненным 5% СО2 при 37 ° С в RPMI1640 и затем помещали под почечную капсулу самцов бестимусных мышей. Тестостероновые гранулы имплантировали дорсально под кожу мышей SCID. Через 12 недель после прививки хозяева были принесены в жертву. Собранные трансплантаты фиксировали в парафине и внедряли для гистологического и иммуногистохимического анализа, как описано [45]. Эксперименты проводились в соответствии с протоколами, одобренными Комитетами по организации и уходу за животными в Университете Алабамы в Бирмингеме и Университете Вандербильта.

Для FISH клетки готовили и обрабатывали, как описано [14]. Анализ SKY проводили, как описано [47], и проводили в Институте анализа рака SKY Roswell Park. Вкратце, метафазные хромосомы были получены обработкой клеток либо колцеидом при 0,06 мкг / мл, либо нокодазолом при 0,5 мкг / мл в течение 2-4 часов. Изображения SKY-DAPI были захвачены с использованием микроскопа Nikon, оснащенного модулем Spectral cube и Interferometer. Спектральные кариотипы были подготовлены с использованием программного обеспечения SKY View (версия 1.62). Численные хромосомные аномалии определялись на основании отклонения от 46 (для диплоидных клеток) или 92 (для тетраплоидных клеток) хромосом на клетку.

Методы иммунофлуоресценции на рисунке S3.

(0.03 MB DOC)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Связь хромосомных аномалий с числом хромосом. Число структурных хромосомных аберраций на клетку или на хромосому было нанесено на график с данными, представленными на рисунке 3 (клетки RWPE1) и Рисунок 6 (клетки hTERT-HME1).

(1,04 МБ TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Поздний проход, полиплоид, PIM-1, экспрессирующие клетки hTERT-HME1, являются опухолегенными in vitro. (A) Вестерн-блоттинг для Pim-1 в раннем и позднем проходе человеческого теломеразы, иммортализованных эпителиальных клеток молочной железы (hTERT-HME1), стабильно экспрессирующих Pim-1. (B) Профиль клеточного цикла PIM-1, сверхэкспрессирующий клетки hTERT-HME1. (C) Анализ мягкого агара клеток hTERT-HME1-Pim-1. (D) Колонии мягкого агара диаметром более 1 мм подсчитывали из 60 мм посуды. Данные представляют собой среднее значение из трех повторных экспериментов. * Р

(1,76 МБ TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Экспрессия клеточных маркеров в сортированных диплоидных и полиплоидных-hTERT-HME1 клетках. Уровень экспрессии CD44, цитокератина 5 и нестина исследовали с помощью иммунофлюоресценции в диплоидных и полиплоидных клетках hTERT-HME1. Между этими двумя клетками нет существенных различий. Вставка, изображение с увеличенным увеличением нестинового пятна.

(2,87 МБ TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Мы благодарим доктора Чишу Сун из Университета Вандербильта за критическое чтение рукописей и полезные обсуждения, д-р Исам-Элдин Эльтум из Университета Алабамы в Бирмингеме за обзор образцов тканей исследований ксенотрансплантата, д-р Сейити Мацуи из парка Розуэлл Cancer Institute SKY для анализа спектрального кариотипирования, и Ирина Дубинская за техническую помощь.

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Финансирование: поддерживается Национальным институтом по лечению рака RO1CA123484. Спонсоры не играли никакой роли в разработке, сборе, анализе или интерпретации данных или подготовке, обзоре или одобрении рукописи.



Источник: rupubmed.com

Подробнее

Наши преимущества

Опыт
Обеспечиваем доставку препаратов из Индии в Россию 10 лет. Налажены тесные и доверительные отношения фарм. компаниями Natco, Hetero, Zydus. 23 000 пациентов прошли лечение успешно. Ваш путь к выздоровлению начинается с нами.
Клиники-партнеры
К вашим услугам профессиональная клиника с сертифицированными врачами. Заказывая у нас оригинальные препараты, вы получаете европейское обслуживание.
Консультации
На протяжении всего лечения и реабилитации. Врачи со специализированным образованием будут сопровождать вас во время терапии и после Реабилитационный период. Полный контроль эффективности лечения- гарантия выздоровления.
100% качество
Препараты проходят контроль на всех стадиях, от синтеза, до отгрузки пациентам. Термо упаковка, экспресс доставка. Брак, подделка исключены на 100%
Цены
Вы получаете доступные цены.
Вы получаете бесплатную доставку.
Вы получаете Скидки.
Мы идем на встречу пациентам в сложную минуту.
Перейти к прайсу
Благотворительность
Малоимущие, многодетные семьи, пенсионеры, инвалиды... все могут рассчитывать на помощь нашего благотворительного фонда и на бесплатное лечение
Отзывы

Листайте отзывы стрелочками

500
миллионов
человек являются носителями
вируса гепатита С
по данным Всемирной Организации Здоровья
5%
ГРАЖДАН В РФ
являются носителями
вируса гепатита С
98%
НАШИХ КЛИЕНТОВ
получают "минус" через 14 дней
после начала приема лекарств
по результатам количественного анализа
Доставка софосбувира
  • Cертифитикаты
    Сертифицированная курьерская служба доставит препараты Вам на дом (время доставки согласовывается). Возможна оплата наличными.
  • Cкорость
    Среднее время доставки в г.Виргиния 2-3 рабочих дня
  • Гарантия
    Перед оплатой вы можете проверить препарат - дата выпуска, наличие голограммы, стоимость в рупиях.
  • Выгода
    Стоимость Доставки 3% от Суммы заказа. Дорого? Позвоните и мы сделаем скидку.
  • Информированность
    Во вложениях диеты, аннотации на русском языке, сертификаты. Ссылки на массовые лабораторные исследования и сертификаты дистрибьюторов мы отправляем онлайн еще до заказа.
Статистика развития гепатита С
  • Интерфероновые схемы лечения излечивали всего до 35-40% пациентов
  • Частота рецидивов после интерфероновой терапии составляет ~ 20%
  • При этом софосбувир в комбинации с даклатасвиром, ледипасвиром или велпатасвиром излечивает 98% пациентов
  • При правильно подобранной комбинации и сроке терапии рецидивов нет!
Наши сертификаты
Часто задаваемые вопросы
Где гарантия что я вылечусь от гепатита С?
У меня очень малый вес, что делать?
Можно ли принимать препараты детям?
Сколько стоит и сколько времени занимает доставка по Москве?
Я проездом в Москве, можно ли получить лекарство на вокзале/аэропорту?
Сколько времени занимает доставка по России?
Нужна ли предоплата?
Какие способы оплаты возможны?
По какому курсу валют происходит расчет?
Оставьте заявку и мы свяжемся с Вами

Мы не передаем Вашу персональную информацию третьим лицам.

Оставьте заявку и мы свяжемся с Вами

Мы не передаем Вашу персональную информацию третьим лицам.

Оставьте заявку и мы свяжемся с Вами

Мы не передаем Вашу персональную информацию третьим лицам.

Оставьте заявку и мы свяжемся с Вами

Мы не передаем Вашу персональную информацию третьим лицам.